研究背景
心脏纤维化是由过度的细胞外基质积累引起的，这一过程通常伴随心脏损伤后的修复反应。然而，过度的修复反应会导致心脏功能障碍，增加心脏的刚性，并破坏心脏的电传导性，最终可能导致心力衰竭。尽管已知有多种分子机制与心脏纤维化的发生密切相关，但目前治疗心脏纤维化的药物仍然处于研发阶段。
本研究的核心目标是通过建立一个多维度药物筛选平台，寻找能够有效治疗心脏纤维化的药物。该平台结合了多种生物模型，包括人类诱导多能干细胞(iPSC)衍生的心脏成纤维细胞、三维工程化心脏组织以及小鼠模型，进行了大规模药物筛选。
研究方法
在心脏纤维化的药物发现过程中，研究人员开发了一个结合不同生物学维度的药物筛选平台。该平台包括细胞模型、三维心脏组织模型和小鼠动物模型，能够从分子到生物体层面进行药物评估。通过这种多维度平台，研究者能够快速筛选出具有潜在治疗效果的药物，并在不同模型中验证其效果。研究人员利用ACTA2报告基因的iPSC衍生的心脏成纤维细胞作为高通量筛选的工具，这些细胞能够有效反映心脏成纤维化过程中的分子变化。
研究结果
多维度药物筛选平台识别抗纤维化化合物
研究人员建立了一个多维度药物筛选平台，该平台结合了人类诱导多能干细胞(iPSCs)，用于筛选化合物库中的抗纤维化药物。筛选结果将化合物分为三类：第一类为弱/非抗纤维化分子，其在Clover2荧光和Hoechst染色强度上表现出较高的数值；第二类为毒性化合物，其Hoechst染色强度较低；第三类为强效抗纤维化分子，其Clover2荧光强度低，且Hoechst染色强度没有降低。例如，弱抗纤维化化合物卡马西平(Carbamazepine)的EC50为10.2 μM。毒性化合物，如penfluridol和actinomycin，显著降低了Hoechst染色强度，表明细胞死亡而非ACTA2表达抑制导致Clover2荧光的减少。相比之下，一种有效的抗纤维化化合物SB431542（TGF-β受体抑制剂）显示出1.5 μM的EC50，但由于全TGF-β抑制可能引起癌变及系统性免疫问题，因此其临床应用受到限制。
通过机器学习(ML)筛选和进一步的ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）预测，研究人员筛选出了20种符合标准的化合物，其中包括了阿托伐他汀(ART)。ART的EC50为2.1 μM，并且在最高浓度10 μM时对iPSC衍生心肌细胞(iPSC-CMs)和内皮细胞(iPSC-ECs)没有毒性作用。经过进一步验证，ART能够抑制人类原代心脏成纤维细胞(CFs)中TGF-β1诱导的ACTA2和COL1A1表达，且在50 μM浓度下不影响原代心脏成纤维细胞的生存率、iPSC-CMs的活力和收缩速度以及iPSC-ECs的活性和一氧化氮(NO)生成。
ART抑制心脏成纤维细胞和3D工程化心脏组织中的MyoFB活化
为了进一步验证ART的抗纤维化效应，研究人员对其进行了一系列功能性研究，评估其在不同条件下的抗纤维化效果。首先，利用多种促纤维化因子（如ANG II、CTGF、TGF-β1等）刺激iPSC-CF，发现ART显著抑制了Clover2荧光强度的增加，表明其具有显著的抗纤维化效应。进一步的实验表明，ART在诱导心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞(MyoFB)转化过程中发挥了重要作用，能够抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞增殖，降低MyoFB的增殖能力，并减缓其迁移速度。
在3D工程化心脏组织(EHT)模型中，ART也表现出抗纤维化作用。通过刺激EHT的iPSC-CMs和iPSC-CFs，ART显著提高了收缩速度和舒张速度，并改善了被TGF-β1刺激后的被动组织张力。ART还显著减少了EHT中ACTA2和COL1A1的表达，表明ART能够有效抑制心脏成纤维细胞在3D心脏组织中的纤维化反应。
临床小鼠模型中的抗纤维化作用
在临床前小鼠模型中，ART通过腹腔注射的方式进行治疗。在横向主动脉缩窄(TAC)手术模型中，ART显著减少了心脏组织中的胶原沉积，改善了左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)，且在4周后，ART处理的小鼠显示出更好的心脏功能。此外，ART治疗显著改善了TAC模型小鼠的舒张功能，减少了通过二尖瓣的血流速度和E/A比值的异常。
此外还通过在缺血再灌注(IR)小鼠模型中进行治疗，进一步验证了ART在另一临床相关模型中的效果。ART显著减少了梗死区域的大小，改善了心脏功能，包括改善了收缩期和舒张期的功能。ART还显著减缓了心室重构过程。
TAC模型中心脏成纤维细胞转分化的动态变化
为了揭示ART在TAC模型中对心脏成纤维细胞转分化的影响，进行了单核RNA测序(snRNA-seq)分析。通过无监督聚类分析，研究者识别出了多个心脏细胞群体，包括心脏成纤维细胞、心肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞和周细胞。通过差异表达基因(DEG)分析发现161个在TAC模型中上调的基因在ART治疗后得到了显著抑制，其中包括与纤维化相关的基因如Col1a1、Col1a2、Postn等。GO和KEGG通路分析表明，这些基因主要参与纤维化发展，如TGF-β信号传导、细胞外基质(ECM)、胶原形成和膜-ECM相互作用。
ART抑制CFs纤维化基因和通路
进一步研究人员分析了ART在CFs中调节的细胞信号传导，发现ART以剂量依赖性的方式抑制TGF-β1或IL-11处理后的人类原代CFs中的MyoFB关键标志物和ECM。另外ART也抑制了人类心肌病MyoFBs中这些纤维化基因的表达。
ART通过分子靶向MD2抑制MyoFB活化
治疗疟疾上，ART通过结合红细胞中的血红素产生ROS发挥作用。但是CFs中并不表达血红素相关基因，因此ART抗纤维化和抗疟疾作用存在不同机制。据报道，ART可以抑制巨噬细胞中的Toll样受体4(TLR4)信号转导。然而，TLR4在CFs中的作用以及ART如何调节TLR4通路尚不清楚。MD2是TLR4的共受体，在配体如脂多糖(LPS)刺激下与TLR4相互作用形成信号转导受体。LPS刺激人原代CFs纤维化基因表达，表明MD2/TLR4激活促进MyoFB活化。进一步分析发现MD2或TLR4敲低可抑制TGF-β1刺激的人原代CFs的转分化，并减弱了MyoFBs的活化。此外MD2/TLR4信号通路抑制剂均抑制了MyoFB的活化。此外研究人员通过离子体共振测量、分子动力学模拟、ELISA等方法进一步证实ART通过靶向MD2有效抑制MyoFB的激活，从而起到抗纤维化作用。
ART抑制MD2-TLR4相互作用及其下游级联反应
最后，研究人员验证了ART可显著抑制MD2-TLR4相互作用及下游通路的激活。采用PLA原位监测相互作用，并使用co-IP在过表达MD2/TLR4的HEK细胞和人原代CFs中进行生物化学检测，发现ART显著抑制MD2-TLR4的相互作用。ERK是MD2/TLR4下游的主要信号通路之一，ART可抑制LPS刺激后的HEK细胞系和TGF-β1刺激后的人原代CFs中的ERK活性。此外，ART抑制了AP1家族中关键成分c-FOS的表达。在TAC诱导的HF小鼠模型的心脏组织中，ERK和c-FOS信号也被ART减弱。综上，研究结果表明，ART通过分子靶向MD2，抑制MD2和TLR4的相互作用，进而抑制胞浆中的ERK和胞核中的c-FOS，从而减少CFs中纤维化基因的表达。
研究结论
本研究通过多维度药物筛选平台识别有效的抗纤维化化合物，并通过多个实验模型验证了其在抗心脏纤维化中的潜力。ART还通过抑制心脏成纤维细胞向MyoFB的转化，改善了心脏功能，并在小鼠模型中表现出了良好的安全性。
参考文献
Zhang, H., Thai, P. N., Shivnaraine, R. V., Ren, L., Wu, X., Siepe, D. H., Liu, Y., Tu, C., Shin, H. S., Caudal, A., Mukherjee, S., Leitz, J., Wen, W. T. L., Liu, W., Zhu, W., Chiamvimonvat, N., & Wu, J. C. (2024). Multiscale drug screening for cardiac fibrosis identifies MD2 as a therapeutic target. Cell, 187(25), 7143–7163.e22. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.034
