研究背景
慢性炎症和组织纤维化是导致器官功能恶化的常见病理反应，但调控二者相互作用的分子机制尚未充分阐明。在病变器官中，压力诱导的基因表达改变推动了细胞状态的适应不良转变，并导致不同细胞群体之间的病理性相互作用。尽管慢性成纤维细胞激活已知会加重肺、肝、肾和心脏的功能障碍，并促进多种癌症的进展，但触发成纤维细胞转录激活的压力感应机制仍未完全明确。
研究方法
所有涉及动物使用的协议均已获得加州大学旧金山分校的机构动物护理和使用委员会的批准，并严格按照国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》进行。研究使用的是年龄匹配的纯C57BL/6J背景的雄性小鼠。小鼠被饲养在一个温度和湿度控制的环境中，遵循12小时明暗循环。Brd4 flox和Cx3cr1creERT小鼠之前已有描述。通过将核糖核蛋白RNP复合物注入到囊胚中，产生了Brd4Flag小鼠，这导致了在内源性Brd4位点的第三个外显子的起始密码子下游立即插入一个3×Flag表位标签以及一个GGGGS柔性连接链。通过PCR扩增筛选创始动物是否引入了3×Flag表位标签，并通过测序确认。阳性创始动物与野生型C57BL/6J小鼠杂交，通过PCR基因分型和测序确认筛选Brd4Flag等位基因的生殖系传递。我们获得了之前由E Pinteaux生成的Il1b条件等位基因的冷冻保存精子。在重新衍生这一系列小鼠后，Cx3cr1creERT;Il1bflox/flox和同胞Il1bflox/flox对照接受了TAC手术。动物与C57BL/6J小鼠杂交超过6代。
纤维化定量。心脏用PBS清洗后，在2%PFA中固定过夜，然后逐级脱水至100%乙醇。对于石蜡包埋，心脏通过自动化系统处理，经过连续的PBS冲洗，递增系列的酒精，Clear Rite 3和Shandon Histoplast在56°C下处理。心脏被包埋在石蜡中并横向切片。代表心室从基部到尖部不同z位置的切片被去蜡、再水化，并根据制造商的协议用Picro Sirius Green染色。切片在二甲苯中透明化，并用DPX封片剂进行组织学封片。使用配备×4物镜的Leica DMi8宽场显微镜获取图像，然后使用FIJI软件进行白平衡。RGB图像随后使用CellProfiler转换为灰度并进行分割，以识别总组织和纤维化组织。纤维化百分比是通过将纤维化组织面积除以总组织面积来计算的。使用Prism 10进行数据分析，使用t检验后跟Welch校正确定统计显著性，P<0.05，因为我们预计各组间方差不等且每组样本数量不同。由于一个样本在一个条件下的纤维化百分比大于所有条件下所有数据点的平均值以上2个标准差，因此排除了一个样本。在分析纤维化时采用了盲法，用字母数字代码标记样本。
研究结果
心脏衰竭细胞状态动态变化与上游信号探索
为了探索心脏衰竭中细胞状态的动态变化，并识别调控压力依赖性转录的上游信号，研究者在小鼠中建立了主动脉弓缩窄(TAC)诱导的心脏衰竭模型，并结合BET抑制剂JQ-1进行治疗。与以往的研究结果一致，JQ-1对心脏功能具有保护作用。通过单细胞RNA测序分析，研究者发现了非心肌细胞的变化，包括成纤维细胞、髓细胞、内皮细胞和周细胞。通过将基因表达与心脏功能进行关联性分析，研究者发现成纤维细胞和髓细胞在心脏功能变化中的转录可塑性最高。
BET蛋白在心脏衰竭中的作用
考虑到BET蛋白作为转录激活因子的角色，研究者分析了BET抑制引起的髓细胞基因表达变化，并发现与心脏功能负相关的上调基因包括Il1β、Ccl8、Ccl12、Cx3cr1和Runx3。通过对髓细胞亚群的分类，研究者发现Il1β和Cx3cr1在特定的细胞群中高度富集，并且JQ-1处理能够抑制这些基因的表达。基于先前研究中BRD4在心脏衰竭中的重要作用，研究者构建了单核-巨噬细胞特异性敲除BRD4的小鼠模型，并进行了TAC建模，结果表明BRD4的敲除能够改善心脏功能并减少纤维化。进一步的实验表明，BRD4对心脏衰竭的促进作用主要来源于外周单核细胞来源的巨噬细胞。
单核巨噬细胞在心脏衰竭中的作用
通过在Cx3cr1creERT2;Brd4flox/flox小鼠中进行的单细胞RNA测序分析，研究者发现单核巨噬细胞是主要的浸润群体，其中特定的细胞群在心脏衰竭中扩增，并在JQ-1治疗后降低。基因本体(GO)注释表明这些细胞群与促炎通路相关，包括LPS反应、炎症反应调节和细胞因子产生。这些细胞群富集的基因包括MHC分子、Il1β和Ccr2等，表明BRD4驱动了促炎相关的转录活动。
成纤维细胞的基因表达变化
研究者进一步探究了心脏衰竭时非细胞自主行为，通过对Cx3cr1creERT2;Brd4flox/flox小鼠的所有心肌细胞进行单核RNA测序分析，发现成纤维细胞和髓细胞显示出类似的差异基因数量。由于成纤维细胞中BRD4的正常表达，这表明成纤维细胞的基因表达变化并非细胞自主行为。聚类分析将成纤维细胞分为多个群，其中特定的群与成纤维细胞活化有关，高表达Postn、Meox1、Comp、Cilp、Mfap4和Thbs4等基因。通过单细胞染色质可及性测序(scATAC-seq)分析，研究者发现在Cx3cr1+细胞中BRD4敲除时，心脏衰竭中细胞的染色质可及性发生了变化，证实了成纤维细胞转录组和染色质组的改变是同步的。对BRD4敲除和对照组成纤维细胞差异可及性区域的Motif分析表明，这些区域富集的转录因子与心脏衰竭中的促纤维化反应有关，如SMADs、MEOX1、RUNX1和REL等，表明Cx3cr1+细胞中BRD4的缺失促进了成纤维细胞的活化。
BRD4缺失对成纤维细胞的影响
研究者进一步探究了Cx3cr1+细胞中BRD4缺失如何影响成纤维细胞。通过对BRD4敲除小鼠CD45+细胞的单细胞染色质可及性测序分析，研究者发现单核巨噬细胞对TAC建模以及BRD4敲除最敏感变化的区域附近的基因为Il1β、Mreg、Cdh26、Cdh23、Cd83、Ccrl2和Egr1。为了进一步揭示BRD4直接调节哪些元件，研究者构建了在BRD4的N端插入3×Flag的小鼠模型，并在TAC建模后分选Cx3cr1+细胞进行CUT&RUN分析，发现相比于对照组，TAC组Cx3cr1+细胞最显著的BRD4结合区域为Il1β、Mreg、Cdh26和Cd83。基于这些结果，研究者发现Il1β是Cx3cr1+细胞中对TAC建模以及BRD4敲除变化最敏感的基因，同时也是与心脏功能显著负相关的细胞因子。公共数据库分析显示RELA转录因子富集在Il1β基因座上。此外，CUT&RUN分析指出BRD4也可能结合在Il1β基因座位的1、2、5和6峰。体外CRISPR-Cas9介导的敲除和荧光素酶报告实验证实5和6峰是BRD4的结合位点。随后，研究者发现Cx3cr1+细胞分泌的IL-1β激活了成纤维细胞。首先，成纤维细胞表达IL-1β受体Il1r1。其次，IL-1β在体外可以促进成纤维细胞αSMA和胶原产生，尤其在与TGF-β联合使用时最为明显。另外，在巨噬细胞和成纤维细胞共培养时，LPS刺激的巨噬细胞可以促进成纤维细胞胶原产生，这个过程却可以被IL-1β中和抗体抑制。IL-1β+TGF-β刺激的成纤维细胞RNA-seq分析差异基因发现促纤维化转录因子MEOX1高表达。siRNA介导的MEOX1敲低显著抑制IL-1β+TGF-β诱导的成纤维细胞胶原产生。有趣的是，体外实验表明RELA和BRD4参与了IL-1β诱导的MEOX1高表达。总之，这些数据表明IL-1β通过MEOX1促进纤维化。
IL-1β阻断对心脏功能和纤维化的影响
最后，研究者检测了体内IL-1β阻断是否能够抑制纤维化并改善心脏功能。团队在野生型小鼠中构建了TAC模型，并给予IL-1β中和抗体或IgG对照。与预期一致，IL-1β中和抗体显著改善了心脏功能并减少了心脏纤维化。由于IL-1β中和抗体可以阻断多种细胞，研究者构建了Cx3cr1+细胞特异敲除IL-1β的小鼠模型(Cx3cr1creERT2;Il1βflox/flox)并与对照小鼠进行TAC建模，发现IL-1β敲除小鼠具有更好的心脏功能。对IL-1β中和抗体实验和Cx3cr1creERT2;Il1βflox/flox小鼠实验心脏的单细胞RNA-seq分析均表明心脏成纤维细胞的促纤维化基因在IL-1β干预后显著降低，例如Postn和Meox1；GO注释分析表明细胞外基质重塑得到显著改善。这些结果均表明IL-1β信号在心脏衰竭时调控成纤维细胞活化的重要作用。
研究结论
本研究揭示了一个特定免疫细胞亚群如何通过BRD4依赖的方式，经由IL-1β与成纤维细胞进行相互作用。这一发现不仅解释了炎症如何驱动促纤维化细胞状态，也为心脏病以及其他存在组织重塑的慢性炎症性疾病提供了新的治疗策略思路。
参考文献
Alexanian, M., Padmanabhan, A., Nishino, T. et al. Chromatin remodelling drives immune cell–fibroblast communication in heart failure. Nature 635, 434–443 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08085-6
