最新进展 | EHJ：TRAP1通过HDAC3介导的组蛋白H4赖氨酸12位点乳酸化促进平滑肌细胞衰老和动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种与衰老紧密相关的复杂疾病，也是全球主要的死亡原因之一。血管平滑肌细胞(VSMC)的衰老在动脉粥样硬化的发展中扮演着关键角色，它不仅导致VSMC数量减少，还可能影响斑块破裂后的修复，增加斑块的易损性。尽管已有研究开发了针对衰老细胞的药物"senolytics"，但其副作用限制了其在临床上的应用。因此，研究VSMC衰老的新机制和寻找新的治疗靶点对于推进动脉粥样硬化治疗至关重要。细胞衰老的特征是细胞应激引起的不可逆的细胞周期停滞，涉及多种因素，包括线粒体功能障碍、异常的癌基因激活和表观遗传改变。衰老细胞释放的衰老相关分泌表型(SASP)会扰乱组织微环境，促进衰老相关的炎症。表观遗传改变和代谢功能障碍是衰老的重要标志，其中乙酰辅酶A和α-酮戊二酸等代谢物在组蛋白修饰和基因表达调控中发挥关键作用。肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)是热休克蛋白90(HSP90)家族的线粒体成员，对调节代谢和细胞器稳态具有重要作用。研究表明，TRAP1通过促进有氧糖酵解积累乳酸，参与代谢重编程，可能在衰老相关疾病中发挥作用。本研究旨在探究TRAP1在VSMC衰老和动脉粥样硬化中的具体作用，通过Ras诱导的衰老VSMC模型和SMC特异性Trap1基因敲除小鼠，结合药物抑制和PROTAC技术，全面评估TRAP1在VSMC衰老和动脉粥样硬化中的功能，为动脉粥样硬化治疗提供新的视角和潜在靶点。

在动脉粥样硬化患者及小鼠模型的主动脉组织中，通过Western blot和RT-qPCR技术检测了TRAP1的表达水平。通过Ras诱导构建了VSMC的衰老模型，并通过测定与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性及其他衰老标志物来评估细胞的衰老状态。此外，通过染色质免疫沉淀(ChIP)分析方法探究了TRAP1在动脉粥样硬化中的可能作用机制。

TRAP1调控血管平滑肌细胞衰老

线粒体功能障碍在细胞衰老的启动中起着重要作用。为了鉴定线粒体与衰老之间的新关联，我们整合了衰老数据库和MitoMiner数据库。发现了35个线粒体基因与衰老相关。接下来，我们使用RT-qPCR技术在由原癌基因Ras诱导的人类血管平滑肌细胞(hVSMCs)中对这些基因的表达进行了分析。值得注意的是，TRAP1被鉴定为在Ras诱导的hVSMCs中显著上调的新型衰老相关基因。因此，我们假设TRAP1参与调控细胞衰老。为了澄清动脉粥样硬化斑块中TRAP1的增加是否伴随着衰老，我们在动脉粥样硬化患者的主动脉组织以及高脂饮食(HFD)喂养的ApoeKO小鼠中测量了TRAP1和典型的衰老标志物（P53、P21和P16）的表达。结果揭示了动脉粥样硬化患者和HFD喂养的ApoeKO小鼠的主动脉组织中TRAP1表达和衰老标志物（P53、P21和P16）显著增加。此外，在HFD喂养的ApoeKO小鼠的斑块中，TRAP1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表现出强烈的共定位，而在对照小鼠中与CD31或CD68没有显著的TRAP1共定位。在Ras诱导的hVSMCs、人类外周血单核细胞和人类主动脉内皮细胞中观察到类似的模式。这些发现表明，TRAP1在动脉粥样硬化中的表达上调，主要在VSMCs中。此外，我们证明了TRAP1缺乏阻止了Ras诱导的hVSMCs中衰老标志物的升高。

TRAP1是衰老VSMCs能量重新编程的关键调控因子

越来越多的证据证实线粒体功能障碍在衰老细胞中驱动能量重新编程。鉴于TRAP1作为线粒体生物能量学的关键调控因子，人们推测它可能参与衰老VSMCs中的能量转换。由于TRAP1主要定位于线粒体，我们的初步研究集中在TRAP1是否影响Ras诱导的hVSMCs的线粒体功能。一致地，通过全内反射荧光显微镜观察到，在Ras诱导的hVSMCs中，TRAP1主要定位于线粒体。TRAP1缺乏改善了线粒体损伤、降低了氧消耗率(OCR)和增加了细胞外酸化率(ECAR)。此外，TRAP1缺乏上调了对线粒体氧化磷酸化至关重要的乙酰辅酶A和柠檬酸的水平。这些变化表明，TRAP1缺乏减轻了Ras诱导的VSMCs能量代谢向糖酵解的转变。此外，我们检测了参与能量代谢的相关酶的表达和活性。己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)和磷酸果糖激酶1(PFK1)是三个关键的糖酵解限速酶。除了在Ras诱导的VSMCs中用小干扰TRAP1(siTRAP1)处理后评估糖酵解限速酶表达（HK2、PKM2和PFK1），我们还同时筛选了参与氧化磷酸化的酶的表达和活性[线粒体三羧酸(TCA)循环酶和电子传递链复合体]。在Ras诱导的VSMCs中，糖酵解限速酶PFK1的表达显著上调，通过siTRAP1得到恢复。这一结果也通过TRAP1药理学抑制剂G-TPP得到证实。相比之下，Ras诱导的VSMCs中TCA循环和电子传递链中的酶表达以及TCA循环酶的活性在有无TRAP1缺乏的情况下均未改变。

TRAP1介导的乳酸积累促进VSMC衰老

鉴于在衰老的hVSMCs中糖酵解的显著上调，重要的是探索乳酸这一糖酵解关键代谢产物在hVSMC衰老中的作用。在用siTRAP1处理的衰老hVSMCs中乳酸产生增加。此外，外源性乳酸补充逆转了siTRAP1处理引起的hVSMC衰老的减少，包括衰老标志物的表达、细胞增殖能力、SA-β-Gal阳性细胞的数量和SASP表达。这些结果表明，TRAP1诱导的VSMC衰老是由乳酸积累引起的。为了进一步验证这一发现，我们使用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)、乳酸脱氢酶抑制剂草酰胺和针对乳酸脱氢酶的siRNA(siLDHA)降低了乳酸产生。与我们的假设一致，乳酸水平的降低显著减轻了VSMC衰老。

TRAP1介导的H4K12la促进衰老VSMCs中SASP激活

为了研究乳酸水平增加促进SASP的机制，我们首先评估了Ras诱导的hVSMCs中蛋白质乳酸化的水平。全局蛋白质乳酸化水平显著增加，这种效应被siTRAP1逆转。值得注意的是，在组蛋白位置附近观察到明显的条带，这促使我们关注组蛋白乳酸化的变化。随后，我们检查了几个先前确认的组蛋白乳酸化位点，发现只有H4K12la水平在Ras刺激下显著升高，这被siTRAP1阻止。这一发现得到了超分辨率荧光成像的进一步支持。然而，其他常见的H4乳酸化位点的表达没有变化。Ras诱导的VSMCs中H4K12la的凝聚导致它们在核包膜中富集，这被siTRAP1阻止。外源性乳酸补充恢复了用siTRAP1处理的Ras诱导的hVSMCs中下调的H4K12la水平。为了进一步证实H4K12la对SASP转录的贡献，我们分析了来自阿尔茨海默病的公开的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据。结果表明，H4K12la在SASP启动子处的富集增加。H3K27ac和H3K4me1是激活的基因组特征的经典表观遗传标记，增强了转录速率。ChIP-qPCR分析证实，Ras在hVSMCs中引起了SASP启动子处H4K12la的富集，以及两个代表性的染色体可及性标记H3K27ac和H3K4me1，这被siTRAP1显著抑制。

HDAC3阻断促进H4K12la上调

p300是一种潜在的乳酸化修饰“写入器”蛋白，而HDAC1-3是delactylase活性的重要调控因子。然而，在衰老的hVSMCs中介导组蛋白乳酸化的调控酶尚不清楚。我们评估了代表性的p300和HDAC1-3的催化功能，并观察到Ras诱导的hVSMCs中HDAC3蛋白表达显著降低，从而鉴定了HDAC3在VSMC衰老中的参与。先前的研究表明乳酸可以下调HDAC3蛋白表达。同样，我们的结果揭示了TRAP1通过乳酸在衰老的hVSMCs中下调HDAC3蛋白表达。西方印迹和免疫荧光染色显示，在HDAC3过表达的衰老hVSMCs中H4K12la显著降低。此外，HDAC3的过表达显著降低了衰老标志物和SASP的表达，同时恢复了细胞增殖能力。为了进一步证实HDAC3对SASP表达的影响，采用了run-on转录技术，发现在HDAC3过表达的衰老hVSMCs中Br-UTP标记的SASP新生转录本显著减少。此外，我们使用了HDAC激动剂ITSA-1来确认HDAC3在由H4K12la介导的VSMC衰老中的作用。ITSA-1与HDAC3过表达具有相同的效果。HDAC3激活有效地阻止了Ras诱导的VSMCs中H4K12la的增加和衰老。与Ras刺激相比，ChIP-qPCR研究表明HDAC3过表达显著降低了SASP启动子处H4K12la的富集，并降低了H3K27ac和H3K4me1的水平。这些结果表明，HDAC3过表达通过降低H4K12la在Ras诱导的VSMCs中减少了SASP转录。Re-ChIP分析进一步揭示了HDAC3和H4K12la与SASP启动子的结合减少。

本研究证明HDAC3（一种组蛋白赖氨酸去乳酸化酶）是VSMCs中H4K12la的关键调控因子，它促进了衰老相关分泌表型的表达，并有助于VSMCs的衰老。本研究为能量代谢重编程与表观遗传修饰之间的联系提供了新的见解，揭示了细胞衰老背后的新机制。此外，我们的发现强调了TRAP1在促进线粒体与细胞核通信中的重要性，并表明抑制TRAP1可能是治疗动脉粥样硬化的一个有效的策略。

参考文献