研究背景
心肌梗死(MI)以心肌损失和由胶原纤维化修复为特征，是全球主要死亡原因之一，带来显著的社会经济负担。尽管再灌注策略和神经体液阻滞疗法显著降低了急性MI患者的死亡率，但针对的治疗仍不理想。更好地理解急性MI及其相关病理生理学，有助于识别新的治疗选择。
骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一部分，通过与II型受体结合并激活I型受体（如激活样激酶，ALK）进行信号转导。BMP9，也称为生长分化因子2(GDF-2)，主要由肝内胆道上皮细胞和肝细胞产生。研究表明，BMP9促进ALK1介导的Smad1/5/8磷酸化。在压力超负荷性心衰中，BMP9通过ALK1/ Smad1/3轴改善心脏功能和减少心脏纤维化。然而，BMP9是否能对抗MI引起的心脏损伤和功能障碍尚未被探讨。
心脏淋巴管在免疫监视和维持组织液体平衡中起重要作用，最新研究显示淋巴管有助于心脏在损伤后恢复功能和促进修复。相反，淋巴功能障碍会加重MI引起的心肌水肿。虽然BMP9在淋巴管的成熟和瓣膜形成中并非必需，但其对MI引起的心脏损伤和功能障碍的保护作用仍需进一步研究。
为此，我们首先评估了BMP9缺失和补充对小鼠MI病理过程的影响，并深入探讨BMP9通过其在肝脏、淋巴和心脏之间的多重作用，影响MI引起的心脏损伤和功能障碍的机制。
研究方法
患者
本研究测量了972名受试者的血清BMP9水平。招募了包含367名受试者的案例对照队列，其中包括133名冠心病(CHD)和MI患者、117名无MI的CHD患者和117名健康对照。此外，还对605名AMI患者进行了回顾性研究。
动物实验
BMP9-/-（BMP9基因敲除）小鼠由北京维视达生物科技有限公司生产，DECR1-/-（2,4-二烯酰辅酶A还原酶基因敲除）小鼠由Cyagen Biosciences Inc.生产。这些小鼠被回交到C57BL/6J背景。所有小鼠在控制温度(23±1℃)和12小时昼夜交替的环境中饲养，并自由获取水和标准啮齿动物饲料。使用8至10周龄的雄性小鼠通过左前降支动脉(LAD)结扎或胸腔淋巴管结扎建立MI模型。腺相关病毒(AAV)通过尾静脉注射引入小鼠。
研究结果
MI患者循环中BMP9水平显著增加，且与心脏功能呈负相关。
本研究招募了367名受试者，包括133名患有冠心病(CHD)和MI的患者、117名有CHD但无MI的患者，以及117名健康对照者，通过免疫分析法测定其血清BMP9水平。结果显示，与健康对照者相比，CHD患者的血清BMP9水平显著增加(284.1[237.5–333.8]vs175.1[147.8–204.6]pg/mL;P<0.001)，在伴有急性心肌梗死(AMI)的CHD患者中进一步增加(381.5[320.3–445.4]vs284.1[237.5–333.8]pg/mL;P<0.001)。偏皮尔逊相关分析显示，血清BMP9水平与左室射血分数(LVEF%)、左室缩短分数(LVFS%)、收缩压、舒张压及NT-proBNP呈负相关，与cTnI、CRP、LDH及LDL-C呈正相关（均P<0.05）。多元线性回归分析结果表明，降脂药物、收缩压及BMP9是cTnI升高的独立危险因素（均P<0.01），提示血清BMP9升高可能与MI发病机制相关。分析还显示，老年（≥60岁）CHD患者的血清BMP9水平显著高于健康对照者(273.8[236.6–324.1]vs175.5[145.4–222.3]pg/mL;P<0.001)，伴有AMI的患者则更高(387.4[318.0–441.1]vs273.8[236.6–324.1]pg/mL;P<0.001)。在以年龄为基础进行分层分析后，BMP9在心血管疾病中的预测效能并未改变。因此，年龄似乎不影响BMP9与MI的相关性。此外，本研究评估了入院时BMP9水平与MI患者发生心力衰竭(HF)之间的关系。在605名MI患者中，随访4.3年，有125名出现HF相关事件。结果显示，AMI伴HF患者的循环BMP9水平显著高于非HF患者(405.0[313.9–564.3]vs368.5[264.0–429.4]pg/mL;P<0.0001)。COX回归分析表明，BMP9水平与HF独立相关，每增加1SD的BMP9，HF风险比为1.73(95%CI,1.41–2.12;P<0.001)。Kaplan-Meier曲线显示，BMP9三份位数高水平组患者的HF风险更高（40.4%vs 20.6%和23.0%）。综上所述，高水平的BMP9是ST段抬高MI患者心力衰竭的重要独立预测因子。
BMP9缺乏加剧了MI诱导的心肌功能障碍和心脏损伤。
为研究BMP9在MI发病机制中的作用，我们通过CRISPR/Cas9技术删除了BMP9基因的特定外显子，生成了BMP9基因敲除(KO)小鼠。在LAD结扎后2周，BMP9 KO小鼠的存活率显著低于野生型(WT)对照组（70.0%对比83.3%）。超声心动图分析结果显示，BMP9 KO小鼠的LVEF和LVFS显著降低（LVEF:21.4%±1.2%对比34.6%±2.7%；LVFS:9.9%±0.6%对比16.7%±1.4%）。同样，通过Masson三色染色和小麦胚芽凝集素(WGA)染色分别评估心脏纤维化区域和心肌细胞大小，这两项指标在BMP9 KO小鼠中均显著增加。心脏纤维化标志物，包括Ⅰ型胶原、TGF-β1和α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白），在BMP9 KO小鼠中也显著上调。考虑到心肌细胞凋亡是MI发病机制中的关键事件，我们评估了BMP9缺乏是否加剧了MI小鼠的心肌细胞凋亡。TUNEL分析显示，BMP9 KO小鼠中TUNEL阳性细胞的百分比明显增高，且cCas-3和Bax的表达水平增加，而Bcl-2（一种抗凋亡因子）则显著降低。这些数据表明，BMP9的缺失加剧了MI诱导的心脏功能障碍和损伤。
补充BMP9改善MI诱导的心脏功能障碍和损伤
用AAV处理的BMP9过表达小鼠(AAV-BMP9)，其循环BMP9水平显著提高，并且在LAD结扎后两周显示出更高的存活率，较AAV-GFP对照组有显著差异。与此一致，接受AAV-BMP9治疗的MI小鼠心脏功能显著改善，心脏纤维化区域和心肌细胞大小均有明显减少。此外，AAV-BMP9还显著降低了心脏纤维化因子的表达，减少了心肌细胞凋亡。通过重组人BMP9(rhBMP9)处理的MI小鼠也获得了类似的结果。综上所述，补充BMP9有效保护心脏免受MI诱导的功能障碍和损伤。
BMP9减轻MI诱导的心脏炎症
鉴于BMP9在炎症性肺损伤中的抗炎作用，我们评估了BMP9在MI情况下对心脏炎症的影响。结果显示，BMP9缺失加剧了炎症细胞在梗死边缘的浸润。此外，BMP9缺失MI小鼠在心脏mRNA水平显示IL-6、IL-1β和TNF-α显著上升。这些不良影响在补充BMP9后显著缓解。
BMP9通过调节淋巴引流功能改善MI诱导的心肌功能障碍和损伤
淋巴管在维持组织液体稳态方面至关重要。先前研究表明，BMP9缺失减少了淋巴瓣数量并导致淋巴结构缺陷。为了评估BMP9对心脏功能的改善是否与淋巴功能改善相关，我们进行了靛青绿(ICG)和伊文思蓝染料扩散实验。结果显示，BMP9缺失导致小鼠淋巴管结构和引流功能异常。
在评估MI后7天的心脏水肿时，MI小鼠心脏湿/干重量比高于假手术组，而BMP9 KO小鼠湿/干重量比进一步升高。AAV-BMP9治疗显著减轻了MI诱导的不良影响，表明BMP9对心脏水肿的保护作用与改善淋巴引流功能相关。
通过胸导管结扎进一步验证了淋巴功能对BMP9保护作用的影响。该处理显著降低了MI小鼠的淋巴流动，增加了心脏湿/干重量比，并加速了心脏纤维化和肥大。在BMP9 KO小鼠中，这些不良影响更加明显。总的来看，BMP9对MI诱导的心肌功能障碍和心脏损伤的保护作用至少部分是通过改善淋巴引流功能实现的。
BMP9通过促进线粒体生物能量学减轻MI诱导的心脏损伤
为进一步探讨BMP9如何保护心脏，我们进行了基于TMT的蛋白质组学分析，鉴定了BMP9 KO和WT小鼠在MI或假手术心脏组织中的差异表达蛋白。共鉴定出128个上调和39个下调的蛋白。基因功能分析显示，这些差异表达蛋白在与线粒体代谢相关的途径中显著富集，尤其是氧化磷酸化和TCA循环。蛋白水平及mRNA水平分析均表明，BMP9缺失加剧了MI诱导的线粒体呼吸功能障碍。随后我们通过透射电子显微镜评估线粒体的超微结构。野生型MI小鼠中可以观察到线粒体形态异常，包括肌原纤维的断裂和线粒体嵴的解体。BMP9 KO小鼠中这种异常更加明显，但在AAV-BMP9处理后得到改善。为了进一步评估BMP9是否通过改善线粒体功能来减轻MI诱导的心脏损伤，我们用rhBMP9处理原代新生大鼠心室肌细胞(NRVMs)24小时。结果显示，rhBMP9显著减少低氧诱导的线粒体分裂，改善了线粒体膜电位和氧耗率，并增加了缺氧状态下的ATP生成。免疫印迹分析进一步证实，rhBMP9治疗下心肌细胞的ETC复合体水平显著恢复。
BMP9在小鼠中增加DECR1表达
我们还研究了是否存在潜在的下游靶标介导BMP9对MI的保护作用。DECR1参与β-氧化和不饱和脂肪酸辅酶A的代谢，是在BMP9 KO和WTMI小鼠之间的39个下调蛋白之一。蛋白质组学分析表明，BMP9 KO小鼠心脏DECR1的丰度显著降低。免疫印迹分析显示，野生型 MI小鼠的心脏DECR1水平显著降低，且在BMP9 KO小鼠中进一步下降，而这一变化在使用AAV-BMP9后显著逆转。由于DECR1是β-氧化中的关键酶之一，我们评估了DECR1是否通过调节线粒体功能来保护心脏免受MI影响。结果显示，DECR1缺失加剧了MI小鼠心肌细胞线粒体的形态异常，过表达DECR1结果则相反。进一步表明DECR1在BMP9介导的心脏保护中的重要性。
研究结论
本文研究结果不仅从临床和基础角度提供了BMP9心脏保护的新证据，并进一步揭示BMP9是通过调节肝脏、淋巴和心脏之间的多器官交互来保护心肌梗死。为MI的机制研究提供了实验理论基础，也为临床干预AMI提供了理论支撑。
参考文献
Duan, Z., Huang, Z., Lei, W., Zhang, K., Xie, W., Jin, H., Wu, M., Wang, N., Li, X., Xu, A., Zhou, H., Wu, F., Li, Y., & Lin, Z. (2024). Bone Morphogenetic Protein 9 Protects Against Myocardial Infarction by Improving Lymphatic Drainage Function and Triggering DECR1-Mediated Mitochondrial Bioenergetics. Circulation, 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.065935. Advance online publication. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.123.065935
