研究背景
心肌梗死(MI)是一种缺血性心脏病，每年约有80.5万美国人发病。尽管干细胞疗法在MI后的心脏修复中已应用数十年，但疗效有限，且受到诸多因素限制，包括生物分布和移植不理想、治疗机制复杂以及不可忽视的致癌和免疫原性风险。研究表明，成体干细胞的主要作用通过分泌旁分泌因子（包括细胞外囊泡）实现。干细胞释放的细胞外囊泡在临床前研究和早期临床试验中显示出治疗效果，尤其在心肌修复中，可通过microRNA介导的信号通路调控起到再生作用。然而，与细胞相比，外泌体在体内的半衰期较短，为了达到治疗效果，需要重复给药。尚缺乏安全、有效、可重复的心脏修复外泌体递送方法，这对实现临床转化至关重要。吸入疗法最初用于治疗呼吸系统疾病已有50多年历史，近来人们对通过这种途径使药物进入全身循环以治疗呼吸道以外疾病的兴趣日益增加，包括用于治疗糖尿病的吸入性胰岛素。然而，采用吸入方式向心脏输送治疗药物的研究有限。为了穿过肺泡毛细血管屏障（气血屏障），吸入颗粒的空气动力学大小应小于5或6 µm，其中小于2 µm的颗粒最适合沉积在肺泡区。我们的初步数据表明，外泌体的平均大小约为100 nm，能够穿过气血屏障进入血液循环，到达受损的心脏。此外，哺乳动物的肺循环中，血液经过气体交换后直接通过肺静脉回流到心脏，这从根本上支持了我们的观点。在我们的既往研究中，肺球状细胞(LSC)衍生的外泌体(LSC-Exos)的吸入给药已在啮齿类动物和灵长类动物中表现出安全性和巨大的再生潜力，能够有效起到抗纤维化和改善血管化的作用。我们还证明了LSC-Exos在冷冻储存前后的稳定性，这为将其作为一种即用型疗法提供了证据支持。LSC及其衍生产品已获准进入治疗呼吸系统疾病的一期临床试验。在LSC-Exos的RNA测序中，我们发现了多种可能对心脏病有益的治疗性microRNA。基于这些初步研究的启发，我们进一步探索了LSC-Exos在心脏疾病治疗中的可行性。在这项研究中，我们开发了干细胞衍生的外泌体雾化疗法(SCENT)用于心脏修复，并在小鼠心肌梗死模型中证实了其疗效，通过单细胞RNA测序确定了关键机制。随后我们在转基因小鼠模型中验证了我们的发现，并且通过在猪身上进行测试拓展了该方法的应用范围。
研究方法
LSC的生成和LSC-Exos的分离
健康人肺组织由北卡罗来纳大学教堂山分校的囊性纤维化和肺病研究与治疗中心提供。LSC中包含祖细胞和支持基质细胞的混合物。LSC-Exos是采用超滤法从人LSC分泌的蛋白中收集和纯化获得。首先将条件培养基通过0.22 µm过滤器过滤，以去除任何细胞或细胞碎片。然后将过滤后的培养基放入100 kDa分子量截留超滤过滤器中，并在5000×g下离心，根据体积，离心10至15分钟。通过过滤离心去除培养基中的杂质或小分子蛋白质，将剩余的外泌体悬浮在PBS中，然后过滤和洗涤。
小鼠心肌梗死模型及吸入程序
简言之，通过腹腔内注射K-X鸡尾酒对C57BL/6小鼠进行麻醉，并通过永久结扎左前降支冠状动脉来造成心肌缺血。心肌梗死后，使用由空气压缩机驱动的雾化器系统连续 7 天每天吸入外泌体或PBS10分钟。小鼠的LSC-Exos剂量通过外泌体颗粒数量确定（1×10¹¹颗粒/100 g）。
研究结果
SCENT疗法将外泌体递送至小鼠的梗死后心脏
SCENT疗法中外泌体通过雾化器输送至远端肺部，随后通过肺泡毛细血管屏障进入循环系统，并最终通过肺静脉输送到缺血心脏。首先，对LSC-Exos进行了形态学表征，包括大小和表面标志物分析。为了验证吸入方式是否适用于外泌体递送，我们研究了吸入外泌体在小鼠体内的生物分布及其在梗死心脏中的募集。离体IVIS成像数据表明，吸入外泌体后10到60分钟内迅速分布在肺部，随后开始在心脏中积聚，与肺部信号的减弱相对应。这表明外泌体从肺部进入血液循环后，被缺血心肌吸收。与单次给药相比，重复给药可在48小时后提高外泌体在心脏中的保留率。通过共聚焦荧光显微镜观察，证实了SCENT的可行性。
SCENT促进小鼠心肌梗死后的心脏修复
通过结扎C57BL/6小鼠的左前降支冠状动脉建立心肌梗死模型。心肌梗死后连续7天，每天通过雾化器吸入LSC-Exo或PBS10分钟。在42天的研究期间，SCENT治疗组的存活率显著高于PBS组和对照组，表明SCENT成功提高了心肌梗死后的存活率。根据超声心动图测量的左心室射血分数和缩短分数，SCENT组的整体左心室功能在短期和长期内均显著优于对照组。此外，组织学研究显示，SCENT治疗显著减少了纤维化组织并增厚了存活的左心室壁，表明SCENT能够减轻心肌梗死后的心脏纤维化和不良重塑。在组织学分析中，SCENT治疗后在心肌梗死后的心脏中发现了大量增殖性心肌细胞，体外实验中，外泌体培养的心肌细胞也表现出更高的增殖水平。此外，SCENT治疗显著减少了心肌细胞的凋亡。总之，SCENT治疗促进了心脏重塑。为了验证其临床相关性，我们还使用了小鼠缺血/再灌注模型，SCENT治疗后的小鼠在第28天的左心室功能显著优于对照组。
SCENT对小鼠其他器官的安全性
评估SCENT对心脏以外其他器官的潜在副作用至关重要。组织学分析显示，接受治疗的小鼠与健康小鼠的肺、脾、肝和肾等器官的组织结构相似，未见器官毒性或炎症。此外，血液检测表明，SCENT治疗对小鼠的肝肾功能无明显影响。肺功能分析结果也显示，SCENT治疗组与对照组之间无显著差异。总体而言，SCENT疗法在患有心肌梗死的小鼠中是安全的。
小鼠心脏的单细胞转录组分析
为了探究SCENT对心肌梗死小鼠的治疗效果背后的基因表达变化，我们对治疗组和对照组的小鼠全心脏进行了单细胞RNA测序。经过数据预处理和质量控制后，我们获得了69,094个高质量的单细胞转录组。通过无监督聚类分析，我们识别了不同的细胞类型，并通过t-SNE图展示了各类型细胞的标记基因表达。结果显示，SCENT治疗后的心肌细胞状况更佳，全转录组验证了SCENT的治疗效果。
SCENT治疗中内皮细胞的转录组反应
我们假设SCENT通过刺激内皮细胞反应来诱导心肌梗死后的心脏修复。内皮细胞是支持缺血心脏氧气供应的血管组成部分，也是外泌体从肺循环进入心脏并积聚的第一个位置。t-SNE分析显示，内皮细胞是SCENT治疗中重要的反应细胞类型。这些结果表明，SCENT疗法在心肌梗死治疗中具有潜在的分子机制，可通过调控内皮细胞反应促进心脏修复。
研究结论
在啮齿动物和猪模型中，我们证明了SCENT治疗急性MI后心肌损伤的可行性、有效性和安全性，为临床研究奠定了基础。此外，EC-Cd36fl/−小鼠模型首次证明条件性EC-CD36敲除可以改善心脏损伤。本研究提供了一种新的心脏疾病的无创治疗方案，并确定了新的潜在治疗靶点。
参考文献
Li, J., Sun, S., Zhu, D., Mei, X., Lyu, Y., Huang, K., Li, Y., Liu, S., Wang, Z., Hu, S., Lutz, H. J., Popowski, K. D., Dinh, P. C., Butte, A. J., & Cheng, K. (2024). Inhalable Stem Cell Exosomes Promote Heart Repair After Myocardial Infarction. Circulation, 150(9), 710–723. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.123.065005
